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論文解讀--諾卡氏菌通過激活線粒體半胱天冬酶途徑誘導牛乳腺上皮細胞凋亡

出處:水生動物健康評估公眾號 作者:楓橋夜泊 水產養殖網 2019-08-26 15:02:00

據報道諾卡氏菌是人類和動物的細胞內病原體。諾卡氏菌可導致局部或全身性諾卡氏菌病,伴有膿或肉芽腫,可能通過吸入、攝入或創傷性植入傳播,并可通過淋巴和血液循環傳播。引起諾卡氏菌病的最重要物種包括奶牛乳腺炎諾卡氏菌、殺鮭諾卡氏菌、巴西諾卡氏菌、鼻疽諾卡氏菌和新星諾卡氏菌。
  
在人類中,諾卡氏菌病的常見表現為肺諾卡氏菌病、中樞神經系統(CNS)諾卡氏菌病、肺外諾卡氏菌病、皮膚、皮下或淋巴皮膚諾卡氏菌病和諾卡氏菌血癥。在牛中,它與慢性鼻疽、流產、肺和全身性諾卡氏病有關。
  在許多細菌病原體中,線粒體依賴性凋亡途徑被公認為主要的致病策略。在此過程中,凋亡因子打開線粒體通透性過渡孔,最終導致膜電位損失和細胞色素C活化。然后細胞色素C結合凋亡蛋白酶激活因子I(apaf-I),誘導寡聚。因此,apaf-1寡聚體與caspase-9的組裝形成凋亡復合體。caspase-9隨后通過caspase-3激活觸發凋亡。然而,在BMEC中,capsase-9激活觸發N.cyriacigeorgica細胞凋亡的具體機制尚不清楚。
  今天,與大家一起學習一篇關于諾卡氏菌對BMEC的細胞死亡效應的文章,文章信息如下:
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粘附和入侵實驗
  細菌粘附和入侵被認為是感染過程中的重要致病和毒力因素,一些體內和體外實驗表明,諾卡氏菌具有粘附和侵入各種類型細胞的能力,從而導致細胞和組織損傷。諾卡氏菌感染可誘導巨噬細胞和樹突狀細胞分化為泡沫細胞。此外,諾卡氏菌的入侵甚至可以導致噬菌體溶酶體融合的預防、蛋白酶體活性的抑制、抗氧化殺傷的抵抗、噬菌體酸化的阻塞以及巨噬細胞溶酶體酶活性的改變。

乳酸脫氫酶(LDH)釋放實驗
LDH是一種酶,通常存在于細胞質中,細菌感染后可通過受損細胞膜釋放到細胞培養基中。低密度脂蛋白釋放分析可用于評價環孢菌對BMEC的細胞病變作用。如圖1所示,在感染1,3,6小時后測得有LDH的釋放。但是在感染12和18小時后,LDH的釋放與對照組相比,有顯著的上升。這些結果表明隨著時間的推移,N. cyriacigeorgica會對BMEC細胞膜造成嚴重的損傷。
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DNA片段化評估
作為凋亡細胞死亡的一個特征,DNA梯被應用于細胞凋亡的驗證。DNA片段如圖2所示。對照組、1、3、6h組和N.cyriacigeorgica對照組BMEC均未見DNA梯狀帶出現。但在感染組12和18小時,觀察到明顯的典型DNA梯狀帶。這些結果表明,N.cyriacigeorgica能誘導骨髓基質細胞凋亡/壞死,感染后12小時觀察到凋亡DNA片段。
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細胞凋亡/壞死分析
 采用膜聯蛋白v/pi雙染色法分析早期凋亡細胞和晚期凋亡/壞死細胞。圖3感染后1和3 h出現的局限性凋亡/壞死。感染后6h細胞早期凋亡率明顯高于對照組(P<0.01)。相對于對照組,感染后6 h細胞凋亡略有增加,感染后12 h和18 h細胞凋亡/壞死變化較感染前顯著增加(P<0.01)。此外,12 h和18h時,晚期細胞凋亡/壞死率均比早期細胞凋亡率高(P<0.01)。此外,18 h(52.26%)總死亡率明顯高于12h(46.99%)。這些數據表明,N.cyriacigeorgica能引起細胞凋亡和壞死,并呈時間依賴性增強。
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掃描電鏡分析
為進一步證實bMECs感染N.cyriacigeorgica后的粘附性、侵襲性、LDH釋放和細胞死亡,利用掃描電鏡(SEM)檢測了bMECs感染N.cyriacigeorgica后與細胞損傷的相互作用。對照組未見形態學改變(圖4A)。感染后6 h,形態學改變為細胞表面部分bMECs和短諾卡菌絲輕度斷裂(圖4B,C)。在12和18 h感染后,bMECs明顯收縮,細胞變態,脫皮,細胞膜破裂,與球形突出出現在某些細胞表面,豐富增長菌絲體覆蓋細胞和纖維細胞膜滲透到細胞外和細胞內(圖4 d I)。特別是在6、12或18 h,掃描電鏡結果表明,細胞表面的微絨毛被諾卡氏菌屬完全包裹纖維(圖4 e、h I)。因此,這些細胞形態的變化表明,N.cyriacigeorgica的滲透和存活可能是上述細胞損傷的原因。
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透射電鏡分析
用透射電鏡(TEM)觀察bMECs感染葡萄球菌后nocardial細胞的內化及超微結構的變化。感染細胞的超微結構變化如圖5所示,包括感染后6 h內質網腫脹、嵴退變、線粒體腫脹、核周間隙擴張(圖5D F);在12 h后感染,泡在細胞表面形成,細胞膜破裂,核膜,染色質凝集,碎片和著邊染色質被發現(圖5 g I)。最后,嚴重破壞的細胞,細胞器,線粒體內密集顆粒積累和觀察,在18 h感染后(圖5 j L)。此外,Nocardial細胞被發現在細胞質和細胞核。這些觀察結果顯示了由臨床N. cyriacigeorgica感染引起的細胞逐漸壞死的過程。
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凋亡分析
前期(1 ~ 6 h)處于相對穩定的線粒體膜電位狀態,nocardial感染晚期12 ~ 18 h,線粒體膜電位明顯減少(p < 0.01),與對照組比較(見圖6)。
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  細胞色素c、caspase-9和caspase-3的western blot結果如圖7所示。感染后1 h線粒體細胞色素c釋放逐漸增加(p<0.05),從1 h開始caspase-9的活化顯著高于對照組(p< 0.01),感染后3 h caspase-3的活化顯著高于對照組(p<0.05)。
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細胞內諾卡菌的生長表明,與對照組相比,12 h后細胞凋亡率明顯增加(p < 0.01)(圖8A,B)。12、18 h時,死亡細胞大多處于早期凋亡階段(p<0.01)。此外,bMECs總死亡率18 h(19.70%)明顯高于12 h (15.80%) (p < 0.01)。令人驚訝的是,革蘭氏染色顯示諾卡菌呈短棒狀,在16小時內無明顯生長;然而,它們在12和18 h時萌發成獨特的長菌絲形式,導致感染細胞的病理形態學改變(圖8C)。細菌計數結果表明,不同培養時間的諾卡菌總數與對照組相比無顯著差異。類似的結果枚舉的胞內諾卡氏菌屬也發現在12 h。這是根據細胞凋亡分析,提出了細胞凋亡顯著增加在12和18 h。細胞內細菌明顯減少(p < 0.01)在18 h與對照組相比(圖8 d)。革蘭氏染色結果和諾卡菌數的不變表明,細胞內和細胞外N.cyriacigeorgica在18 h的孵育過程中都是由小棒向菌絲生長而不是繁殖(圖8C,D)。在Nocardia生長旺盛的12、18 h,細胞凋亡明顯加劇(圖8A C)。
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結語
這些結果表明臨床N.cyriacigeorgica能夠粘附和侵入bMEC,導致細胞膜破壞和線粒體變性。文章的數據支持這樣的假設:N.cyriacigeorgica通過細胞凋亡機制誘導宿主細胞死亡,并且N.cyriacigeorgica感染的后期在bMECs中遵循線粒體依賴性凋亡途徑。這些研究結果表明,bMECs的細胞凋亡是通過觸發caspase級聯誘導的,并可能對牛乳腺組織中N.cyriacigeorgica感染的機制提供重要的見解。

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